支持與應用
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【色譜知識分享】HPLC常見問題討論
發(fā)布時間：
2024-09-06
HPLC常見問題
分析與討論
我們在進行高效液相色譜實驗時常常會遇見各種峰型問題，例如峰拖尾、峰展寬等，除此之外還有保留異常與基線異常，影響實驗的定量甚至定性。
為了更好解決以上問題，掌握色譜技術(shù)，本篇推文將從高效液相色譜常見峰型異常、保留異常與基線異常三個方面進行討論。
1 峰型異常
實驗中常見的異常峰型有目標峰前后有小峰、拖尾峰/峰展寬、前沿峰、負峰、肩峰(雙峰)、鬼峰等情況。
1.1 目標峰前后有小峰
（1）樣品不純——可以通過調(diào)整色譜條件或者更換色譜柱解決；
（2）分析柱/保護柱的柱頭塌陷——該情況較為常見，此時往往所有的峰都分裂，可以清洗或者再生色譜柱；
（3）柱容量下降——色譜柱使用較長時間后，一些強保留的組分會吸附在柱內(nèi)，可采用強洗脫溶劑清洗色譜柱，或者更換色譜柱；
（4）溶劑效應——樣品溶劑與流動相洗脫能力相差大，可更換樣品溶劑；
（5）樣品分解
1.2 拖尾峰
（1）色譜柱塌陷——更換柱子
（2）pH不合適——堿性化合物可在流動相里添加1%左右的三乙胺，再用磷酸調(diào)回酸性**。
（3）管路沒接好——液相色譜管線的差異也會導致峰型變化，管線死體積大會導致峰拖尾，可以更換管線；
（4）濾頭堵塞、填料脫落——維修或更換色譜柱；
（5）柱子被污染——使用強洗脫能力的溶劑如乙腈、甲醇等清洗色譜柱；
（6）體積過載、質(zhì)量過載——一般離子型化合物與體積過載時容易產(chǎn)生寬峰，此時可在流動相中加入三氟乙酸(TFA)。質(zhì)量過載時峰呈現(xiàn)三角狀，可適當降低進樣濃度或體積；
圖1 樣品質(zhì)量過載
圖2 降低進樣量后樣品峰正常
（7）溶劑效應——樣品溶劑與流動相洗脫能力相差大，可更換樣品溶劑
**酸性條件下,三乙胺率先占據(jù)固定相中的高能位點，屏蔽堿性化合物與固定相的吸附作用，從而改善峰形。但當遇到堿性比三乙胺更強的堿性化合物時，其作用就不明顯了
1.3 前沿峰
（1）色譜柱過載——樣品進樣量大，可以降低進樣量或降低樣品的濃度；
（2）流動相pH不恰當——調(diào)整pH
（3）柱溫低
（4）色譜柱損壞
1.4 負峰/倒峰
（1）流動相吸附底值過高——適當改變波長；
（2）進樣時進入了空氣——排氣；
（3）溶劑效應——樣品溶劑與流動相洗脫能力相差大，可更換樣品溶劑；
（4）樣品折射率小——示差檢測器的信號是折射率，當組分折射率小于流動相時即出現(xiàn)倒峰，可改變流動相添加劑或改變檢測波長；
（5）參比波長設置不合適——在二極管陣列檢測器中，設置的參比波長有紫外吸收，從而導致色譜峰峰高降低甚至出現(xiàn)倒峰，可通過關閉參比波長來解決
1.5 肩峰/雙峰
（1）樣品不純——此時只有少部分的色譜峰為肩峰，其他的色譜峰為正常的色譜峰。改變流動相或色譜柱，選擇合適的分離條件；
（2）化合物含有特殊結(jié)構(gòu)——其在特殊條件下存在動態(tài)平衡，此時可使用堿性流動相或用特殊方法解決，如衍生化；
（3）色譜柱損壞——若進標準液后仍然產(chǎn)生肩峰，可以判斷是色譜柱損壞
1.6 鬼峰
（1）檢測器進氣泡——平衡時基線規(guī)律地產(chǎn)生波動，有可能是檢測器進氣泡了，此時可以卸下色譜柱，用甲醇/乙腈清洗系統(tǒng)；
（2）上一個樣品遺留的組分影響——此時的鬼峰往往保留時間不同，可用大比例有機相沖洗5~10min
2 保留異常
2.1 保留時間短
（1）可更換色譜柱。未被鍵合的硅羥基和化合物中的極性基團產(chǎn)生氫鍵或發(fā)生離子交換作用，使極性化合物保留增強；
（2）加入離子對試劑。但是離子對試劑對于色譜柱的損傷較大，難以沖洗干凈，且易堵塞機器
2.2 目標峰不保留
（1）化合物極性弱——這是比較常見的原因，而此時使用水/甲醇或水/乙腈體系不太容易洗脫下來?？梢赃x擇在不流動相中加入少量的異丙醇，增強流動相的洗脫能力。
3 基線異常
實驗過程中遇到的基線問題一般是基線噪音高、基線漂移與基線波動，大多都是由于儀器的問題造成的。
3.1 基線噪音過高
（1）氘燈老化——氘燈的使用時間有500、1000、2000h等，超過使用時間后可能出現(xiàn)基線噪音高的問題，此時應更換氘燈；
（2）檢測器流通池被污染——卸下色譜柱，用水或甲醇沖洗流通池；
（3）參數(shù)設置——有些儀器可以修改靈敏度，靈敏度越大，響應越高，基線噪音也就越大
3.2 基線漂移
（1）平衡不充分——初次使用色譜柱時至少要用10 ~20 倍柱體積平衡色譜柱。若流動相中含有離子對試劑或者使用HILIC模式的色譜柱應采用50~100 倍柱體積平衡體系。示差檢測器平衡較慢，參比池和樣品池至少需要用流動相平衡2h以上。若波長過低也需延長平衡時間；
（2）梯度洗脫酸度不平衡——在梯度洗脫時，隨著有機相的增加，流動相的酸度降低，使基線漂移，可以在有機相中也加入同比例的酸；
（3）氘燈老化——更換氘燈；
（4）檢測器流通池被污染——卸下色譜柱，用水或甲醇沖洗流通池
3.3 基線波動
（1）流動相有氣泡——停泵，重新超聲流動相，延長排氣時間；
（2）流通池進氣泡——若基線和壓力規(guī)律波動，一般懷疑是流通池內(nèi)進了氣泡。若為示差檢測器，可以提高廢液瓶擺放位置，增加背壓，減少氣泡產(chǎn)生幾率；
（3）單向閥堵塞——若泵長時間走純乙腈或者高比例乙腈，單向閥容易堵塞，此時可以拆卸單向閥進行超聲清洗；
（4）流動相混合不均——流動相通過比例閥進行液體的混合，可以采用單泵預混的方式減少基線波動；
（5）檢測器流通池被污染——卸下色譜柱，用水或甲醇沖洗流通池
本次推文對HPLC常見色譜異常及其原因的進行了多方面的分析，并提出相應的解決方法，為液相實驗的操作提供一定的參考及依據(jù)。
參考文獻：
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